Identification of putative histopathological markers of anoikis resistance in colorectal carcinoma and their clinical significance

Academic dissertation to be presented with the assent of the Doctoral Programme Committee of Health and Biosciences of the University of Oulu for public defence in the Leena Palotie auditorium (101A) of the Faculty of Medicine (Aapistie 5 A), on 19 September 2025, at 12 noon

Abstract

Anoikis is a form of apoptosis triggered by epithelial cell detachment from the extracellular matrix (ECM). Cancer cells need anoikis resistance (AR) to survive in intravascular transit and foreign ECM. While fundamental to metastasis, AR characterisation in histological samples remains unexplored. MUC1 overexpression is proposed as an AR mechanism and is linked to poor prognosis in colorectal cancer (CRC).

This study aims to identify and quantify CRC cell subpopulations resistant to anoikis and assess their clinical significance. We analysed a prospective series of 149 surgically treated CRC patients, 61 with lymph node metastases (LNM) from 2006 to 2010. Putative anoikis-resistant subpopulations (pAR) were identified as cell groups with lower apoptosis rates than other cells, as measured by the immunohistochemical M30-index, despite lacking contact with ECM and ECM proteins laminin and type IV collagen.

pAR showed greater abundance in LNMs than in their primary tumours, suggesting selective survival of pAR-forming cells. In cases with multiple LNMs, the smallest LNMs had higher pAR densities than primary tumours, while the largest LNMs matched primary tumour density, suggesting a transient increase in pAR density early after metastatic colonisation. MUC1 expression was higher in pAR than in the general carcinoma cell population, and MUC1 correlated with high pAR density. While MUC1 in primary tumours lacked prognostic value, high MUC1 in LNMs was associated with poor cancer-specific survival and synchronous distant metastasis. High pAR density in primary tumours and LNMs correlated with worse cancer-specific survival, with a cumulative prognostic effect when measured from both sites.

Our results show that CRC contains cell subpopulations without ECM contact and lacking increased apoptosis rate. These pAR were enriched in LNMs suggesting their positive selection during metastasis. The high pAR density in small and, therefore, young metastases suggests the mechanisms promoting their formation were activated during metastasis.

Given AR’s fundamental role in metastatic progression and AR mechanism activation during metastasis, our findings support pAR are related to true AR. MUC1 overexpression in pAR supports this concept. High pAR density is a marker of adverse prognosis in primary CRC and LNMs, while high MUC1 is associated with adverse prognosis only in LNMs.Tiivistelmä

Anoikis on ohjelmoidun solukuoleman muoto, joka käynnistyy epiteelisolun menettäessä kontaktin solunulkoiseen matriksiin (ECM). Anoikisresistenssi (AR) mahdollistaa syöpäsolujen selviytymisen imuteissä, verenkierrossa ja vieraassa kudoksessa. Vaikka AR on metastaasin edellytys, sitä ei ole karakterisoitu histologisista näytteistä. MUC1-yliekspressiota on esitetty AR-mekanismiksi sekä ennustetekijäksi paksu- ja peräsuolisyövässä.

Tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa ja kvantifioida anoikisresistenttejä solupopulaatioita suolisyövästä sekä arvioida niiden kliinistä merkitystä. Tutkimme 149 vuosina 2006–2010 kirurgisesti hoidettua potilasta, joista 61:llä oli imusolmukemetastaaseja (IM). Tunnistimme anoikisresistenteiksi oletettuja solupopulaatioita (pAR), joilta puuttui kontakti ECM:iin ja ECM-proteiineihin laminiini ja tyypin IV kollageeni mutta oli silti matala apoptoosifrekvenssi. Apoptoosi-indeksi määritettiin immunohistokemiallisesti M30-vasta-aineella.

pAR-tiheys oli suurempi IM:issa kuin primaarituumoreissa, mikä viittaa pAR:iden valikoitumiseen. Pienimmissä IM:issa oli korkeampi pAR-tiheys kuin tapauksen primaarituumoreissa, kun taas suurimpien IM:ien pAR-tiheys vastasi primaarituumoria, viitaten ohimenevään pAR-tiheyden kasvuun metastaattisen kolonisaation alkuvaiheessa. MUC1-ekspressio oli korkeampi pAR:issa kuin yleisessä syöpäsolukossa ja MUC1 assosioitui pAR-tiheyteen. Primaarituumoreiden MUC1:lla ei ollut ennustearvoa, mutta korkea MUC1 IM:issa liittyi huonompaan syöpäspesifiseen eloonjäämiseen ja synkronisiin kaukometastaaseihin. Korkea pAR-tiheys sekä primaarituumoreissa että IM:issa liittyi syöpäspesifiseen kuolleisuuteen ja vaikutus oli kumulatiivinen.

Tulosten perusteella suolisyövässä on solupopulaatioita, jotka selviytyvät ilman ECM-kontaktia, eikä niissä havaita apoptoosilisää. pAR:iden rikastuminen IM:ihin viittaa niiden valikoitumiseen. Korkea pAR-tiheys on ennustetekijä primaarissa suolisyövässä ja sen IM:issa, kun taas korkea MUC1 on ennustetekijä vain IM:ista määritettynä. Havaintomme vahvistavat käsitystä AR:n perustavanlaatuisesta roolista metastaattisessa progressiossa ja tukevat pAR:iden ilmentävän todellista AR:ä. MUC1-yliekspressio pAR:issa tukee tätä tulkintaa. Korkea pAR-tiheys toimii huonon ennusteen merkkinä sekä primaarissa suolisyövässä että IM:issa, kun taas korkea MUC1 liittyy huonoon ennusteeseen vain IM:issa.