Männyn endosymbionttisten bakteereiden leviäminen vieraassa isäntäkasvissa

Abstract

Endofyytit ovat bakteereita, jotka kykenevät kolonisoimaan kaikkia kasvin osia ja auttamaan kasvia kasvussa ja kehityksessä. Endofyyttejä, jotka kolonisoivat kasveja solunsisäisesti kutsutaan endosymbionteiksi, ja niihin kuuluvat männystä löytyneet bakteerit Methylorubrum extorquens DSM13060 ja Pseudomonas synxantha DSM13080.

Tässä tutkielmassa M. extorquens DSM13060, johon oli lisätty fluoresoiva vihreä markkeriproteiini (GFP), inokuloitiin steriileihin ja epästeriileihin saintpaulia – kasveihin, ja bakteerin kolonisaatiota seurattiin mikroskopoimalla kasvileikkeitä koeasetelman aikana. Lisäksi P. synxantha DSM13080:lle kehitettiin markkeriproteiini käyttäen PpsbA:mNeonGreen ja PpsbA:mRuby2 - konstrukteja. Tarkoituksena oli siirtää kyseiset konstruktit P. synxantha DSM13080 bakteerin genomiin, ja tätä varten konstruktit muokattiin tämän tutkielman aikana kloonaamalla. Myöhemmin ne voidaan siirtää pBK-miniTn7-ΩGm - plasmidivektoriin, joka kykenee siirtämään geenimateriaalin bakteerin genomiin yhdessä pUX-BF13-auttaja - plasmidin kanssa.

Kloonauksen avulla inserttikonstrukti PpsbA:mNeonGreen saatiin valmiiksi, jotta se voitaisiin siirtää pBK-miniTn7-ΩGm – vektoriin. Vektori myös saatiin melkein valmisteltua kyseistä vaihetta varten. Lisäksi mRuby2 – geeni saatiin eristettyä ja monistettua, ja se voitaisiin seuraavaksi siirtää pJET1.2:PpsbA – vektoriin seuraavia vaiheita varten. Kloonauksessa restriktioreaktioiden puhdistus osoittautui haastavaksi vaiheeksi, mutta siihen ratkaisuna voisi olla ”Gibson assembly”-menetelmä, jonka avulla voitaisiin ohittaa ongelmakohdat ja suorittaa kloonaus suoraviivaisemmin.

Tutkielman aikana steriili saintpaulia saatiin kolonisoitua onnistuneesti M. extorquens DSM13060 bakteerilla. Epästeriili kasvi ei kolonisoitunut pysyvästi, mikä voi viitata siihen, että M. extorquens DSM13060 ei kykene kilpailemaan kolonisaatiossa muiden maaperän bakteereiden kanssa. Näin ollen M. extorquens DSM13060 voi luonnossa olla pääosin vertikaalisesti, eli siementen avulla, uusiin isäntäkasveihin siirtyvä bakteeri. M. extorquens DSM13060 kolonisoi saintpaulia - kasveja solunsisäisesti, joten se voisi vaikuttaa vieraan isäntäkasvin kasvuun samoilla mekanismeilla kuin männyssä. M extorquens DSM13060 voisi siis olla tulevaisuudessa hyödyllinen luomulannoitteena, ja onnistuneesti kolonisoitua saintpauliaa voitaisiin jatkossa käyttää esimerkiksi pölytyskokeissa testaamaan endosymbiontin siirtymistä uusiin kasveihin kukkien kautta.