Molecular mechanisms of Methylorubrum extorquens DSM13060, a growth-promoting endosymbiont of pine, for developing improved future biofertilizers

Abstract

Abstract

Endophytic bacteria reside within the living tissues of plants and are an important component in plant microbiome. They promote plant tolerance to fluctuating environmental conditions along with growth and development, which is a focal point in enhancing crop production. This study aims to understand the mechanisms of an endosymbiont Methylorubrum extorquens DSM13060, which thrives inside the meristematic tissues of Scots pine (Pinus sylvestris L.) providing advantages to the host. M. extorquens DSM13060 does not produce any common phytohormones for plant growth promotion. During their entry, they consume pine-derived methanol to produce poly-3-hydroxybutyrate (PHB). This compound provides protection against oxidative stress for both the endosymbiont and the host through its fragments, methyl-esterified 3-hydroxybutyrate (ME-3HB) oligomers. I have analyzed the involvement of genes in the production of ME-3HB oligomers and thereby host colonization. Gene deletions of PHB depolymerase (phaZ1), synthase (phaC), and transcription factor (phaR) showed the importance of PHB metabolism for host colonization by M. extorquens DSM13060. This study also revealed their capacity to employ an ankyrin-repeat protein, Ank_2, to manipulate the host nuclear processes. It has a unique capacity to accumulate intracellularly around host nuclei. This was hampered by the deletion of the Ank_2 gene, which affected both colonization and growth promotion in pine. A yeast two-hybrid assay showed that Ank_2 interacts with an extracellular plant cell wall degrading enzyme GH17b and nuclear proteins BCCIP, BZIP49, and NUP54, which affect the success of colonization and plant development. The high-resolution secondary ion mass spectrometry (NanoSIMS) study showed the ability of the endosymbiont to transfer carbon and nitrogen-based compounds to the pine meristematic cells. This study complements the picture of the endosymbiosis of M. extorquens DSM13060 with Scots pine by interconnecting the different levels of the interaction. In this unique endosymbiosis, PHB metabolism is required for entry, Ank_2 is the key component for successful colonization, and the exchange of compounds during the interaction portrays the mutualism of endosymbiosis. My study on Scots pine and M. extorquens DSM13060 interaction has given a new outlook on symbiotic associations in plants and encourages the use of endosymbionts as future biofertilizers.

Tiivistelmä

Endofyyttiset bakteerit elävät kasvien solukoissa ja ovat tärkeä osa kasvien mikrobiyhteisöä. Ne edistävät kasvien sietokykyä muuttuvia ympäristöolosuhteita vastaan ja tehostavat kasvien kasvua ja kehitystä, mikä on ollut viime vuosina kasvintuotannon painopisteessä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli ymmärtää mekanismeja, joiden avulla endosymbiontti Methylorubrum extorquens DSM13060 viihtyy männyn (Pinus sylvestris L.) meristemaattisissa soluissa tarjoten etuja isännälleen. M. extorquens DSM13060 ei tuota yleisiä kasvihormoneja kasvien kasvun edistämiseen, mikä poikkeaa normaalista endofyyttisestä elämäntavasta. Infektoidessaan kasvia M. extorquens DSM13060 kuluttaa männyn tuottamaa metanolia poly-3-hydroksibutyraatin (PHB) tuottamiseksi. Tämä yhdiste tarjoaa suojan oksidatiivista stressiä vastaan sekä endosymbiontille että isännälle fragmenttiensa, metyyliesteröityjen 3-hydroksibutyraatti (ME-3HB) -oligomeerien kautta. Tässä työssä olen analysoinut ME-3HB-oligomeerien tuotannosta vastaavien geenien osallistumista endofyytin kolonisaatioprosessiin. PHB-depolymeraasin (phaZ1), PHB-syntaasin (phaC) ja transkriptiotekijän (phaR) geenideleetiot osoittivat PHB:n metabolian tärkeyden kolonisaatiossa. Deleetiokanta ΔphaR tunkeutui isäntään pääasiallisesti solujen välitilojen kautta, ja ΔphaZ1-kannalla oli heikompi kolonisaatiokyky kuin kontrollilla. Deleetiokanta ΔphaC oli herkkä 10 mM HO·:lle ja 20 mM H2O2:lle, eikä päässyt männyn solukoiden sisälle, eläen pääasiassa männyn juurten ja versojen pinnoilla. Tämä tutkimus paljasti myös M. extorquens DSM13060:n mekanismin käyttää ankyriinitoistoproteiinia, Ank_2, muokkaamaan isännän tumakeskeisiä prosesseja. Ank_2-geenin deleetio esti kolonisaation männyssä sekä M. extorquens DSM13060:n ainutlaatuisen kyvyn kerääntyä isäntäsolujen tumien ympärille. Tämän seurauksena endosymbiontti ei enää lisännyt männyn taimien kasvua. Hiivan kaksoishybridimenetelmä osoitti, että Ank_2 on vuorovaikutuksessa solunulkoisen kasvin soluseinämää hajottavan entsyymin GH17b ja tumaproteiinien BCCIP, BZIP49 ja NUP54 kanssa, jotka mahdollisesti vaikuttavat kolonisaatioon ja kasvin kehitykseen. Korkearesoluutioinen sekundaari-ionimassaspektrometriatutkimus (NanoSIMS) paljasti endosymbiontin kyvyn siirtää hiili- ja typpipohjaisia yhdisteitä männyn meristemaattisiin soluihin. Tämä tutkimus täydentää kuvaa M. extorquens DSM13060:n endosymbioosista männyn kanssa yhdistämällä vuorovaikutuksen eri tasoja toisiinsa. Siten tässä ainutlaatuisessa endosymbioosissa PHB-aineenvaihdunta vaaditaan pääsyyn kasvin sisälle, Ank_2 on avainkomponentti onnistuneelle kolonisaatiolle, ja yhdisteiden vaihto vuorovaikutuksen aikana kuvaa endosymbioosin vastavuoroisuutta. Tutkimukseni männyn ja M. extorquens DSM13060 vuorovaikutuksesta on antanut uuden näkökulman kasvien symbioottisiin suhteisiin ja rohkaisee endosymbionttien käyttöä tulevaisuuden biolannoitteina.

<div lang="en" class="abs"> <p class="abs_header">Original papers</p> <ol type="I"> <li> <p>Baruah, N., Haajanen, R., Rahman, M. T., Pirttil&auml;, A. M., &amp; Koskim&auml;ki, J. J. (2024). Biosynthesis of polyhydroxybutyrate by Methylorubrum extorquens DSM13060 is essential for intracellular colonization in plant endosymbiosis. Frontiers in Plant Science, 15, 1302705. https://doi.org/10.3389/fpls.2024.1302705 <a href="https://doi.org/10.3389/fpls.2024.1302705">https://doi.org/10.3389/fpls.2024.1302705</a></p> </li> <li> <p>Baruah, N., Koskim&auml;ki, J. J., Mohammad Parast Tabas, H., Velasco, X. R., Frank, A. C., &amp; Pirttil&auml;, A. M. (2024). An ankyrin-repeat protein plays a crucial role in plant colonization by an endosymbiont. Manuscript submitted for publication. </p> </li> <li> <p>Koskim&auml;ki, J. J., Baruah, N., Moore, K., Li, K., Miinalainen, I., Salo, H. M., Aronen, T., Frank, A. C., &amp; Pirttil&auml;, A. M. (2024). High-resolution secondary Ion Mass Spectrometry reveals the transfer of nitrogen and carbon between bacterial endosymbiont and plant host in the meristematic tissue of a conifer. Manuscript in preparation. </p> </li> <li> <p>Pirttil&auml;, A. M., Mohammad Parast Tabas, H., Baruah, N., &amp; Koskim&auml;ki, J. J. (2021). Biofertilizers and biocontrol agents for agriculture: How to identify and develop new potent microbial strains and traits. Microorganisms, 9(4), 817. https://doi.org/10.3390/microorganisms9040817 <a href="https://doi.org/10.3390/microorganisms9040817">https://doi.org/10.3390/microorganisms9040817</a></p> <p><a href="https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2021051730086">Self-archived version</a></p> </li> </ol> </div>

<div lang="fi" class="abs"> <p class="abs_header">Osajulkaisut</p> <ol type="I"> <li> <p>Baruah, N., Haajanen, R., Rahman, M. T., Pirttil&auml;, A. M., &amp; Koskim&auml;ki, J. J. (2024). Biosynthesis of polyhydroxybutyrate by Methylorubrum extorquens DSM13060 is essential for intracellular colonization in plant endosymbiosis. Frontiers in Plant Science, 15, 1302705. https://doi.org/10.3389/fpls.2024.1302705 <a href="https://doi.org/10.3389/fpls.2024.1302705">https://doi.org/10.3389/fpls.2024.1302705</a></p> </li> <li> <p>Baruah, N., Koskim&auml;ki, J. J., Mohammad Parast Tabas, H., Velasco, X. R., Frank, A. C., &amp; Pirttil&auml;, A. M. (2024). An ankyrin-repeat protein plays a crucial role in plant colonization by an endosymbiont. Manuscript submitted for publication. </p> </li> <li> <p>Koskim&auml;ki, J. J., Baruah, N., Moore, K., Li, K., Miinalainen, I., Salo, H. M., Aronen, T., Frank, A. C., &amp; Pirttil&auml;, A. M. (2024). High-resolution secondary Ion Mass Spectrometry reveals the transfer of nitrogen and carbon between bacterial endosymbiont and plant host in the meristematic tissue of a conifer. Manuscript in preparation. </p> </li> <li> <p>Pirttil&auml;, A. M., Mohammad Parast Tabas, H., Baruah, N., &amp; Koskim&auml;ki, J. J. (2021). Biofertilizers and biocontrol agents for agriculture: How to identify and develop new potent microbial strains and traits. Microorganisms, 9(4), 817. https://doi.org/10.3390/microorganisms9040817 <a href="https://doi.org/10.3390/microorganisms9040817">https://doi.org/10.3390/microorganisms9040817</a></p> <p><a href="https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2021051730086">Rinnakkaistallennettu versio</a></p> </li> </ol> </div>