HRP-labeling of bacterial extracellular vesicles for transmission electron microscopy imaging

Abstract

Extracellular vesicles (EVs) are small, membrane-bound carriers secreted by all cells. In humans, in addition to body’s own cells, also the bacteria of the microbiota releases bacterial EVs (BEVs). BEVs in human body can be examined from body fluids. For studying BEVs derived from gut microbiota, fecal samples are used. The isolation protocol of BEVs includes ultrafiltration, size-exclusion chromatography, and density gradient ultracentrifugation. For characterization, transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis are commonly used. Several methods for labeling and imaging EVs have been demonstrated. Yet, none of them are suitable tracking EVs with high resolution imaging. In this thesis, a novel horseradish peroxidase (HRP) -labeling for BEVs for transmission electron microscopy (TEM) is established. For visualizing the HRP, carrying out a diaminobenzidine (DAB) -reaction had to be optimized. With multiple trials of in vitro experiments, a suitable protocol for labeling BEVs was established. As a result of successful HRP-labeling followed by DAB-reaction, BEVs appeared sharply stained on the edges. Further trials in ex vivo conditions were performed by injecting HRP-labeled BEVs to a muscle of a euthanized mouse. Thin sections of mouse muscle tissue in TEM revealed dark-stained clusters of structures resembling BEVs. The outcomes of the ex vivo mouse experiment were promising but will require optimizing in future studies.

Kaikki solut erittävät ulkopuolelleen kuljetukseen erikoistuneita pieniä kalvopeitteisiä rakkuloita, solunulkoisia vesikkeleitä. Solunulkoisia vesikkeleitä tuottavat paitsi elimistön omat solut, myös elimistössä elävän mikrobiomin solut. Ihmiselimistön suolistobakteerien tuottamia bakteeriperäisiä solunulkoisia vesikkeleitä tutkitaan ulosteesta, joiden eristämiseksi määrittämiseksi ja tutkimiseksi yhdistellään useita eri menetelmiä. Myös vesikkeleiden leimaamiseen ja kuvaamiseen on kehitetty useita menetelmiä, mutta mikään niistä ei sovellu solunulkoisten vesikkeleiden seurantaan läpäisyelektronimikroskoopilla. Tässä työssä testattiin menetelmää bakteeriperäisten solunulkoisten vesikkeleiden leimaamiseen piparjuuriperoksidaasilla (horseradish peroxidase, HRP). HRP:n havaitsemiseksi menetelmää varten optimoitiin myös diaminobentsidiinireaktio (DAB). Useiden kokeilujen jälkeen sopiva protokolla bakteeriperäisten solunulkoisten vesikkeleiden leimaamiseksi saavutettiin in vitro -olosuhteissa. Onnistuneen leimaamisen seurauksena läpäisyelektronimikroskoopissa nähtiin terävästi reunoiltaan värjäytyneitä bakteeriperäisiä solunulkoisia vesikkeleitä. In vitro -osuuden jälkeen kokeiluja jatkettiin ex vivo -olosuhteissa injektoimalla HRP-leimattuja vesikkeleitä lopetetun hiiren lihakseen. Läpäisyelektronimikroskoopissa lihaksesta tehdyissä ohutleikenäytteissä nähtiin rykelmiä tummaksi värjäytyneitä, vesikkeleitä muistuttavia rakenteita. Tulokset ex vivo -osuudesta olivat lupaavia, mutta vaativat vielä lisätutkimusta tulevaisuudessa.