Ligniinin mallikomponenttien entsymaattinen valorisaatio

Abstract

Tässä tutkielmassa perehdytään ligniiniin ja sen mallikomponenttien valorisaatioon, sekä siitä saatavien fenolisten yhdisteiden hyötykäyttöön. Ligniini on epätavallisen rakenteen omaava polyfenoli, joka on selluloosan jälkeen kasvin yleisin rakennekomponentti. Ligniinin muodostumisreaktiossa radikaaliyhdisteet liittyvät toisiinsa luoden epäsymmetrisen kolmiulotteisen polymeerin. Ligniinin monimutkaisessa rakenteessa esiintyy useita yksinkertaisia fenoleita, joita voidaan erottaa yhdisteestä ja käyttää lukuisissa reaktioissa lähtöaineina. Erotus on kuitenkin haastavaa, joten ligniinin pääkäyttökohde onkin energiantuotannossa poltettuna.

Lehtipuiden ligniinissä esiintyy kahta erilaista aromaattista ydintä: guajasyyli- ja syringyyliydintä. Näistä ytimistä voidaan vastaavasti johtaa guajakolia (2-metoksifenoli) ja syringolia (2,6-dimetoksifenoli). Guajakolista voidaan vuorostaan johtaa 3-metoksi-L-tyrosiinia, jota lääketeollisuudessa käytetään aihiolääkkeenä L-dopa syöpälääkkeelle. L-tyrosiinijohdannaisten synteesiä katalysoidaan käyttämällä tyrosiinifenolilyaasi entsyymiä (TPL). TPL tarvitsee toimiakseen pyridoksaali 5’-fosfaattia (PLP) kofaktorina. TPL kykenee katalysoimaan reversiibeliä reaktiota, jossa fenoli, pyruvaatti ja ammoniumioni reagoivat muodostaen L-tyrosiinin johdannaisia. Reaktiossa voidaan käyttää entsyymin GMO-varianttia M379V, joka on todistetusti soveltuvin variantti reaktiolle, jossa fenolina toimii guajakoli.

Lehtipuiden ligniinin aromaattisista johdannaisista, guajakolista ja syringolista, voidaan guajakolia hyödyntää L-tyrosiinijohdannaisten muodostumisreaktiossa substraattina. Syringoli kuitenkin vaikuttaa tyrosiinifenolilyaasin toimintaan eri tavalla kuin guajakoli, mikä on tässä tutkielmassa mielenkiinnon kohteena.

Kokeellisessa osuudessa tutkitaan guajakolin reagointia 3-metoksi-L-tyrosiiniksi, sekä syringolin mahdollista vaikutusta entsyymin toimintaan. Tämän lisäksi tutkinnan alla on entsyymin olomuodon vaikutus reaktioon, sekä koejärjestelyistä syntyvä virheprosentti. Syringolin vaikutusta tarkastellaan kolmesta reaktiosta, joissa syringolin konsentraatiot ovat eri suuruisia. Reaktioissa fenolisena substraattina toimi guajakoli. Reaktioiden lähtöaineet olivat puhtaita kemikaaleja.

Koetuloksia tarkastellessa keskitytään kokeiden reaktionopeuksiin, sekä substraattien kulutuksiin ja konversioihin. Astiassa, jossa syringolia ei ollut ollenkaan, havaittiin stabiilimpi reaktionopeus, sekä suurempi substraatin kulutus. Virheprosenttien mittauksissa arvot pysyivät viitteiden sisällä, joten voidaan olettaa tuloksien olevan luotettavia. Entsyymin olomuotojen vaikutuksen tutkinnassa huomattiin entsyymin kokosolumuodolla olevan suurempi tuotto, kuin entsyymin kylmäkuivatulla lysaatilla.

Näillä tuloksilla voidaan tulevaisuudessa optimoida erilaisia reaktiosarjoja, joissa on tarkoituksena käyttää ligniiniä synteettisen reaktion lähtöaineena. Tämän lisäksi koesarjojen tuloksia voidaan käyttää apuna määritettäessä tuleville reaktioille tarpeellista entsyymin olomuotoa.

This study examines lignin and its valorization, as well as the utilization of phenolic compounds derived from it. Lignin is an unusually structured polyphenol that, after cellulose and hemicellulose, is the most common structural component of a plant. In the lignin formation reaction, radical compounds bond together to form an asymmetric three-dimensional polymer. There are several simple components in the complex structure of lignin that can be separated from the compound and used as raw materials in numerous reactions. However, breaking lignin into its basic components is challenging, so the main use of lignin is in energy production as fuel.

There are two different nuclei in lignin derived from hardwood: guaiacyl and syringyl nuclei. Guaiacol (2-methoxyphenol) and syringol (2,6-dimethoxyphenol) are phenolic compounds that can be derived from these nuclei, respectively. Similarly, 3-methoxy-L-tyrosine, which is used in the pharmaceutical industry as a prodrug for the anti-cancer drug L-dopa, can be synthesized from guaiacol. The synthesis of L-tyrosine derivatives is catalyzed using the enzyme tyrosine phenol lyase (TPL). TPL requires pyridoxal 5’-phosphate (PLP) as a cofactor to function. TPL can catalyze a reversible reaction in which phenol, pyruvate, and ammonium ion react to form an L-tyrosine derivative. The GMO variant of the enzyme, M379V, can be used in the reaction, which has been proven to be the most suitable variant for a reaction where guaiacol is the main phenolic substrate.

Out of the phenolic derivatives from hardwood lignins, guaiacol and syringol, guaiacol can be utilized as a substrate in the formation of L-tyrosine derivatives. However, the way syringol behaves around tyrosine phenol lyase differs from guaiacol, which is the main point of interest in this study’s experimental section.

The experimental part of the study examined the reaction of guaiacol to 3-methoxy-L-tyrosine, as well as the possible effects of syringol on the enzyme. In addition to this, the enzyme’s forms effect on the reaction, as well as the error rate of the experiments, were under investigation. To examine the effect of syringol, three reactions were performed with different concentrations of syringol. In the reactions, the phenolic substrate was guaiacol. The substances in the reactions were pure chemicals.

Examination of the results focused on the reaction rates of the experiments, as well as the consumption and conversions of the substrates. In a vessel without syringol, a more stable reaction rate was observed, as well as higher consumption than in vessels to which syringol had been added. In the error rate measurements, the values remained within the references, so the results can be assumed to be reliable. In the study of the effect of enzyme states, it was found that the whole cell form of the enzyme produces a higher yield than the enzyme as lyophilized lysate.

These results can be used to optimize various reaction series in the future with the intention of using lignin as a source of substances. In addition, the results of the experiments can be used to help determine the state of the enzyme required for future reactions.